In het kader van de doelstellingen van Amgen betreft dit meestal de isolatie van een menselijk gen met therapeutisch vermogen, dat vervolgens wordt ingebracht in bacteriën, gisten of een dierlijke cellijn. Zonder deze recombinant DNA technologie, zijn de meeste van deze eiwitten niet in voldoende hoeveelheden beschikbaar. Door gebruik te maken van recombinant DNA technologie kan het eiwit onder gecontroleerde omstandigheden in grote hoeveelheden geproduceerd worden. Uiteindelijk kunnen zo zeer grote hoeveelheden van een zeer zuiver eiwit voor klinisch gebruik geproduceerd worden.
De recombinant DNA technologie die hierboven beschreven is, is vrij gemakkelijk te begrijpen. Door gebruik te maken van eiwitten die restrictie-enzymen worden genoemd, worden individuele genen van het menselijk DNA geïsoleerd en ingebracht in kleine circulaire DNA fragmenten die gesplitst zijn met hetzelfde enzym. Deze circulaire DNA fragmenten worden plasmiden genoemd. Eenmaal ingebracht in het plasmide, kan het gen ter plaatse geassembleerd worden met een ander enzym. Dit enzym wordt DNA ligase genoemd. Restrictie-enzymen en DNA ligase zijn de knip- en plakenzymen van de recombinant DNA technologie.
Het recombinant plasmide wordt ingebracht in een bacterie, gist of een gekweekte diercel. Dit proces heet transformatie. Amgen gebruikt hiervoor de bacterie Escherichia coli (E. coli); bakkersgist en een aantal zoogdiercellijnen (bv de Chinese Hamster Ovarium cellijn (CHO cellen) voor de productie van darbepoetin alfa).
De getransformeerde cellen worden gescheiden van de niet-getransformeerde cellen. Wanneer deze cellen gekloond worden ontstaat een zuivere populatie recombinante cellen. Door middel van klonen ontstaat uit één enkele cel een populatie van identieke cellen of klonen. Er wordt vanuit gegaan dat alle gekloonde cellen een kopie bevatten van het plasmide dat het ingebrachte menselijke gen bevat.
Vervolgens worden alle cellen gestimuleerd om aan te slaan of het menselijke gen tot expressie te brengen. Afhankelijk van het geselecteerde celsysteem, kan het recombinant eiwit teruggevonden worden in de cellen of erbuiten in het omringende medium. Hoewel bovenstaande misschien eenvoudig lijkt, is dit het absoluut niet. Het heeft 3 jaar geduurd om het gen voor recombinant humaan erytropoëtine te klonen.
Amgen is zeer succesvol gebleken in het onderzoek naar hematopoëtische groeifactoren. Hematopoëtische groeifactoren zijn eiwithormonen die door ons lichaam geproduceerd worden om de productie en de rijping van verschillende bloedvormende cellen te reguleren.
Bovenstaande figuur toont hoe ongespecialiseerde precursorcellen zich ontwikkelen tot gespecialiseerde cellen zoals erytrocyten, leukocyten en bloedplaatjes. Deze ontwikkeling wordt deels begeleid door verschillende eiwitten. Sommige van deze factoren hebben een zeer specifieke rol, terwijl andere een meer algemene functie lijken te hebben.
Amgen maakte gebruik van “genetic engineering” om de genen voor sommige van deze eiwitten te isoleren. Twee van deze eiwitten zijn: erytropoëtine en granulocyte-colony stimulating factor, beter bekend als de producten recombinant humaan erytropoëtine en NEUPOGEN® (Filgrastim). Aan de hand van recombinant humaan erytropoëtine wordt uitgelegd hoe“ genetic engineering” werkt.
Erytropoëtine is een eiwit hormoon dat geproduceerd wordt door specifieke cellen in de nieren. Zoals eerder vermeld, stimuleert erytropoëtine de progenitor cellen in het beenmerg om rijpe erytrocyten (rode bloedcellen) te vormen.
Patiënten met chronische nierfalen zijn vaak niet in staat om voldoende hoeveelheden erytropoëtine te maken om normale erytropoëtine concentraties in de circulatie te hebben.
Als gevolg hiervan lijden deze patiënten vaak aan chronische en ernstige anemie (bloedarmoede). Dit betekent dat ze een laag aantal rode bloedcellen in de circulatie hebben. In sommige gevallen hebben deze patiënten naast dialyse frequent bloedtransfusies nodig om adequate spiegels rode bloedcellen te behouden.
Aangenomen werd dat de anemie t.g.v. chronische nierziekten verholpen zou kunnen worden wanneer een externe bron van erytropoëtine beschikbaar zou zijn. Helaas produceert het lichaam erytropoëtine in zeer kleine hoeveelheden, waardoor het ondenkbaar is voldoende natuurlijk erytropoëtine te isoleren om alle patiënten met deze ziekte te behandelen.
Dit is het terrein waar de recombinant DNA technologie – en Amgen – ten tonele verschijnen.
Bij Amgen werd het onderzoek om het humane erytropoëtine gen te klonen geleid door Dr. Fu Kuen Lin. Het team van Dr. Lin kreeg in het begin zeer kleine hoeveelheden humaan erytropoëtine van medewerkers van de Universiteit van Chicago. Dit materiaal werd gebruikt om de de volgorde van aminozuren in het erytropoëtine molecuul te bepalen.
Met behulp van deze sequentie informatie konden zeer korte DNA fragmenten ontworpen worden, oligonucleotiden genoemd. Deze oligonucleotiden zouden kunnen overeenkomen met de humane erytropoëtine DNA sequentie. Tegelijk werden er fragmenten van het humaan DNA dat het gen voor erytropoëtine zou kunnen bevatten, willekeurig gekloond in bacteriën. Vervolgens werden de korte DNA fragmenten gebruikt als markers om het erytropoëtine gen te identificeren. Deze techniek heet autoradiografie.
Op deze manier werd door Dr. Lin het humane gen voor erytropoëtine geisoleerd. Dit menselijk gen werd vervolgens gekloond in een ovarium cellijn van de Chinese Hamster. Op deze manier kan het humane erytropoëtine eiwit geproduceerd worden. Deze cellijn wordt vandaag de dag nog steeds gebruikt voor de productie van recombinant humaan erytropoëtine.
Na het klonen van het erytropoëtine gen hebben zeer veel mensen gewerkt aan het ontwikkelen van een succesvol product. Hierbij moet gedacht worden aan: het klinisch onderzoek; het uitbreiden en opzetten van het productieproces; het indienen van een registratie aanvraag; de bescherming van het patiënt en het succesvol in de markt zetten van het product.
De nieuwere producten van Amgen worden nog steeds door middel van biotechnologie geproduceerd. De productie van Aranesp® en Neulasta® gaat echter nog een stapje verder dan het klonen van een gen en het zuiveren van het geproduceerde eiwit. Aranesp® wordt geglycosyleerd. Dit wil zeggen dat oligosaccharide eenheden worden toegevoegd aan het geproduceerde eiwit. Hierdoor ontstaan er andere bindingen. Bij de productie van Neulasta® wordt gebruik gemaakt van een pegylatie techniek. Een polyethyleen glycol (PEG) molecuul wordt gehecht aan het standaard groeifactor molecuul. Dit leidt tot een groter molecuul dat langer in het lichaam aanwezig blijft.
